酶聯免疫吸附法（ELISA）原理與分類

更新時間：2024-06-25

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原理：

酶標抗體法，又名酶聯免疫吸附法（ELISA），利用酶標記抗原或抗體以檢測相應抗原或抗體的一種免疫學標記技術。其基本原理是使抗原或抗體結合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性，而相對應的抗體或抗原與某種酶連接成酶標抗體或抗原，酶標抗體或抗原既保留了免疫活性可以與固相載體表面的抗原或抗體結合，又保留了酶活性能夠以酶為檢測信號，加入酶反應的底物后，底物被酶催化為有色產物，產物的量與受檢抗體或抗原的量成比例，故可根據顏色深淺來定性或定量分析。酶標抗體法具有靈敏性強，特異性高，重復性好，檢測速度快的特點，尤其適用于大批量樣本檢測，是國際認可的標準化診斷方法。

基本操作步驟：

包被—封閉—加樣—孵育一抗—洗滌—孵育二抗—洗滌—顯色—終止—讀數

分類：

依據檢測目的不同，酶標抗體法有間接法，雙抗體夾心法，競爭法和抗體捕獲法等。

1.間接法

主要是利用酶標記的抗抗體檢測已與固相結合的受檢抗體，是檢測抗體常用的方法。將特異性抗原與固相載體連接，形成固相抗原，洗滌除去未結合的抗原及雜質。加入稀釋的受檢樣品（如血清），樣品中特異性抗體與抗原結合，形成固相抗原抗體復合物。經洗滌后固相載體上只留下特異性抗體。其他免疫球蛋白及雜質由于不能與固相抗原結合，在洗滌過程中被洗去。加入酶標抗抗體與固相復合物中的抗體結合，從而使該抗體間接地標記上酶。洗滌后固相載體上的酶量就代表特異性抗體的量。最后加底物顯色，依據顏色深度代表標本中受檢抗體的量。

2.雙抗體夾心法

檢測抗原常用的方法。將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體，洗滌除去未結合的抗體及雜質。加受檢標本，使之與固相抗體接觸反應一段時間，讓標本中的抗原與固相載體上的抗體結合，形成固相抗原復合物。洗滌除去其他未結合的物質。加酶標抗體使固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結合，洗滌未結合的酶標抗體，此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢物質的量正相關。夾心式復合物中的酶催化底物成為有色產物。根據顏色反應的程度進行該抗原的定性或定量。

3.競爭法

可用于測定抗原，也可用于測定抗體。以測定抗原為例，受檢抗原和酶標抗原競爭與固相抗體結合，因此結合于固相的酶標抗原量與受檢抗原的量呈反比。將特異抗體與固相載體連接，形成固相抗體，洗滌后加入受檢標本和一定量酶標抗原的混合溶液，使之與固相抗體反應。如受檢標本中無抗原，則酶標抗原能順利地與固相抗體結合。如受檢標本中含有抗原，則與酶標抗原以同樣的機會與固相抗體結合，競爭性地占去了酶標抗原與固相載體結合的機會，使酶標抗原與固相載體的結合量減少。參考管中只加酶標抗原，孵育后酶標抗原與固相抗體的結合可達最充分的量。洗滌后加底物顯色，參考管中由于結合的酶標抗原最多，故顏色最深。參考管顏色深度與待測管顏色深度之差代表受檢標本抗原的量。待測管顏色越淺，表示標本中抗原含量越多。

4.抗體捕獲法

血清中針對某些抗原的特異性IgM常和特異性IgG同時存在，后者會干擾IgM抗體的測定。因此測定IgM抗體多用捕獲法。先將所有血清IgM（包括異性IgM和非特異性IgM）固定在固相上，去除IgG后再測定特異性IgM。將抗IgM抗體連接在固相載體上，洗滌后加入稀釋的血清標本，洗滌后加入特異性抗原，洗滌后再加入酶標抗體，最后洗滌加底物顯色。

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